Latar Belakang

Spektrofotometri merupakan salah satu teknik yang dapat digunakan untuk mengukur konsentrasi dan menganalisis kemurnian DNA dan RNA. Parameter dasar tersebut penting diketahui sebelum melakukan analisis lebih lanjut terhadap asam nukleat (DNA dan RNA) seperti PCR, qPCR, sekuensing, dan DNA mikroarray. Konsentrasi DNA ditentukan dengan mengukur absorbansi DNA pada λ260 nm yang dihubungkan dengan faktor pengencerannya.

Sedangkan kemurnian DNA ditentukan dengan menghitung rasio absorbansi pada λ260/280 dan 260/230 nm untuk melihat apakah terdapat kontaminasi protein atau senyawa kimia.

Kedua parameter dasar tersebut dapat dengan mudah diukur menggunakan SpectraMax® QuickDropTM Spectrophotometer (UV-Vis). Spektrofotometer ini memiliki port mikro volume 0.5 mm, cuvette dan LCD layar sentuh yang mudah digunakan (friendly used) dan memungkinkan pengguna untuk melakukan berbagai eksperimen pada satu sistem.

Dalam analisis ini ditampilkan kemampuan SpectraMax® QuickDropTM Spectrophotometer (UV-Vis) untuk menentukan konsentrasi dan kemurnian asam nukleat dengan tingkat akurasi dan konsistensi yang tinggi.

Bahan dan Metode

Alat dan bahan yang digunakan adalah SpectraMax® QuickDrop TM Spectrophotometer (Molecular Devices cat. #QUICKDROP), UltraPureTM Calf Thymus DNA Solution (Thermo Fisher cat. #15633019), RNA Control 250 ng/μl (Thermo Fisher cat. #AM7155) dan 10 mm Far UV Quartz Cuvettes (Starna Cells cat. #9-Q-10)

Analisis sisa sample

Analisis sisa sample diukur dengan membandingkan konsistensi hasil pengukuran pada λ260 nm antara sample dan ultra-pure water. Sebelum digunakan, port micro volume selalu dibersihkan terlebih dahulu dengan kain bersih.

Linearitas kurva standar

Serangkaian konsentrasi sample dibuat dengan melakukan pengenceran dimulai dari konsentrasi double-stranded DNA (dsDNA) 2500 ng/μl. ultra-pure water digunakan sebagai blanko.

Absorbansi setiap sample diukur mulai λ230-320 nm dengan menggunakan program DNA quantification pada SpectraMax® QuickDrop TM Spectrophotometer. Setiap pengukuran sample dan blanko diulang 3x dan Konsentrasi DNA (μg/ml) secara otomatis diukur dengan persamaan= (A260-A320) x faktor pengenceran x 50 μg/ml.

Setelah itu, data konsentrasi dari masing-masing pengenceran akan dianalisis menggunakan SoftMax® Pro Software dan the SoftMax Pro Import Feature sehingga dapat dilihat linieritas hasil pengukuran.